近日，我院刘俊秋、闫腾飞团队在Angewandte Chemie International Edition上发表了题为“A Temperature-Sensitive Dual Ion Channel Based on Quinoline Helix for H+/Cl− Cotransport With Remarkable Antitumor Effect”的研究论文，构建了一种具有高效传输能力的温敏型H⁺/Cl⁻共转运人工双离子通道，并将其应用于抗癌治疗领域。该人工通道P2由两个相互连接的质子通道（喹啉螺旋）和氯离子通道（规则排列的硫脲基团）组成，使H+和Cl-平行的跨膜运输成为可能。与此同时，该双离子通道展现出其卓越的温度可逆响应性。这一特性使其能够在生理条件下精确激活，为其在癌症治疗中的潜在应用奠定了基础。平面脂质双层记录进一步证实P2表现出单通道导电率39.2 ± 1.7 pS，且其导电率随着温度升高显著增加，证实了该双通道的温度敏感门控行为。值得注意的是，P2通过离子干扰机制破坏癌细胞稳态，导致线粒体膜电位丧失并释放细胞色素c，最终诱导癌细胞凋亡，实现对肿瘤细胞(IC50 = 0.14 μM)的高效抑制。该双离子通道不仅是一种强效抗癌剂，也为未来功能性离子通道的设计提供了新思路。
受天然通道蛋白精准门控与特异性离子运输能力的启发，人工离子通道的开发旨在模拟其动态响应功能，以克服天然蛋白提取复杂、应用受限等不足。尽管已有大量基于大环宿主（如冠醚、柱芳烃等）的人工系统实现了对阳离子或阴离子的选择性识别与运输，并在门控响应性方面取得进展，但多数系统仍局限于单一离子运输，难以模拟天然通道中多离子协同完成复杂生理功能的行为。因此，如何将阳离子/阴离子协同运输与环境响应性整合于同一人工通道体系，仍是该领域面临的重要挑战。基于此，本研究设计了一种基于喹啉螺旋的温度敏感型双离子通道，通过同时传输H+和Cl-，实现对癌细胞稳态的干扰，为人工通道在抗癌治疗中的应用提供新思路。根据本团队之前报道过一种经典喹啉螺旋，其构象主要由酰胺N-H与喹啉N原子之间的分子内氢键所稳定。该螺旋结构中，酰胺键与喹啉N原子共同构筑了连续的氢键网络，形成孔径约为0.1 nm的质子传导通道，为跨膜质子运输提供了高效通路 (Nano Lett.2021, 21, 10462–10468）。
本论文在此基础上，引入3,5-双（三氟甲基）苯基异硫氰酸酯。随后形成的硫脲基团分布在螺旋两侧，作为Cl-的连续结合位点。通过MALDI-TOF质谱、凝胶渗透色谱 (GPC)、红外光谱法对P2进行了表征。MALDI-TOF质谱显示其重复单元分子量与理论值一致，GPC测定其数均分子量 (Mn) 为10088 Da，多分散指数 (PDI) 为1.306。为研究P2的跨膜离子运输活性，本研究采用pH敏感性荧光探针HPTS，通过建立跨膜pH梯度监测离子运输过程。实验表明，P2不运输碱金属阳离子，EC50为9.84 pM (图1a)；阴离子选择性顺序为NO3- > Br- > Cl- > SO42-。SPQ实验进一步证实P2介导高效的Cl-运输，EC50为0.6 μM (图1b,c)。机制研究表明，FCCP未显著改变荧光强度，表明H+运输快于Cl-，而缬氨霉素实验显示Cl-运输优先于OH-，两者共同表明P2通过H+/Cl-同向协同转运机制发挥作用 (图1d,e)。CF染料泄漏实验证实P2不破坏膜完整性，而是通过形成跨膜单分子孔道介导离子运输 (图1f)。
图1.离子通道输运活性及机制研究
为验证P2的温度响应特性，我们考察了不同温度下其离子传输活性的变化。利用HPTS荧光探针结合温度循环水泵精确控温，发现P2的H+传输速率随温度升高显著增加 (图2a)，且对照实验排除了温度对囊泡稳定性的干扰。同时，SPQ实验也证实Cl-传输表现出类似的温度依赖性增强 (图2c)。进一步通过37°C与5°C的循环切换实验，P2展现出可逆的温度门控开关行为，在37°C时活性较高，降至5°C时显著下降，且该动态传输特性可稳定循环三次以上而无疲劳效应 (图2b,2d)，确认了P2具备良好的温度可逆响应性。为验证P2是否具备自组装成离子通道的能力，我们构建了平面脂质双层膜系统，并进行了电生理记录实验，当温度从5°C升至37°C时，氯离子单通道电导率(γCl-)显著上升，从11.6 pS升至48.3 pS，表明高温有效提升了跨膜离子传输效率 (图2e-h)。
图2. P2对离子输运的温度依赖性调控
基于P2优异的H⁺/Cl⁻同向协同转运性能，我们进一步探究了其抗癌潜力。研究选用多种癌细胞系 (4T1、A549、U-87 MG) 进行CCK-8实验。结果表明，P2对癌细胞表现出显著的细胞毒性，尤其对U-87 MG细胞效果最佳 (IC50 = 0.14 μM) (图3a-c)。流式细胞术进一步证实，P2通过H+/Cl-同向协同转运破坏离子稳态，以浓度依赖方式诱导U-87 MG和A549细胞凋亡，凋亡率从5.4%升至94.4% (图3d)。Calcein-AM/PI活死染色结果与CCK-8实验一致，再次验证了P2浓度依赖性地诱导癌细胞死亡。
图3.P2通过破坏离子稳态诱导癌细胞凋亡。
为验证P2能否介导细胞内Cl-内流，本研究采用Cl-荧光探针MQAE对U-87 MG细胞进行检测。结果显示，加入P2后，细胞内荧光发生明显猝灭，表明P2有效促进了Cl-的跨膜内流 (图4a)。在凋亡机制层面，JC-1探针检测表明P2能够浓度依赖性地诱导线粒体膜电位丧失，伴随ROS水平升高(图4b,e)。进一步免疫荧光染色显示，细胞色素c从线粒体释放至细胞质，表明线粒体通透性转换孔开放，进而激活caspase依赖性凋亡通路 (图4c)。此外，鉴于P2具备H+转运活性且肿瘤细胞溶酶体呈酸性，采用LysoTracker Deep Green探针检测发现P2处理后溶酶体绿色荧光显著减弱 (图4d)，证实P2可促进溶酶体质子外流、升高其pH，进而诱导溶酶体膜通透性增加并释放凋亡相关因子至胞质。综上，P2通过介导Cl-内流与H+外排，破坏细胞内离子稳态，并经线粒体和溶酶体双通路协同触发癌细胞凋亡。
图4.细胞凋亡机制
为评估P2的体内抗肿瘤效果，本研究建立BALB/c裸鼠U-87异种移植瘤模型，每两天尾静脉注射P2(0.14,0.40,0.65 μM)，连续治疗14天。结果显示，P2呈浓度依赖性地抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率(TGI)分别为52.9%、69.9%和74.6% (图5c,d)；H&E染色进一步证实肿瘤组织出现明显的核碎裂、核溶解等凋亡与坏死特征，而心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织结构完整，未见明显炎症或损伤 (图5e)。治疗期间小鼠体重未见异常变化，表明P2具有良好的生物相容性 (图5b)。综上，P2通过介导H+/Cl-同向协同转运破坏肿瘤细胞离子稳态，有效诱导肿瘤细胞死亡，同时展现出较低的体内毒性，具备作为抗肿瘤药物的开发潜力。
图5. P2的体内抗肿瘤效果
该论文第一作者为硕士生武艳婷同学，通讯作者为杭州师范大学刘俊秋教授、闫腾飞副教授。该工作得到国家自然科学基金等项目的资助与支持。
原文链接https://doi.org/10.1002/anie.1809937