近日，我院刘俊秋教授团队在Chemical Engineering Journal上发表了题为“Photo- and Ligand-Boosted Ion Transport and Cancer Cell Apoptosis via an Azobenzene-Appended Hyperbranched Polymer-Based Artificial Proton Transport System”的研究论文，提出了一种利用光和配体促进人工质子通道离子传输的策略，并增强抗肿瘤效果。该通道（H3-AZO）通过将偶氮苯基团修饰到超支化聚合物上合成得到。与天然质子通道类似，H3-AZO由于能够形成多重氢键链，可实现高效、快速（γ_H⁺ = 103 ± 3 pS，约为天然短杆菌肽A的一半）且选择性的质子传输。H3-AZO中偶氮苯基团的光致异构化，以及与β-环糊精形成主客体复合物，可进一步加速质子传输，从而促进肿瘤细胞死亡。传输活性的变化归因于膜嵌入效率的改变。机制研究表明，H3-AZO诱导的质子传输可导致线粒体和溶酶体损伤，最终引发显著的肿瘤细胞凋亡（B16F10细胞IC₅₀：0.38 µM；U87MG细胞IC₅₀：0.47 µM）。该工作将有助于揭示天然通道蛋白精妙的多重调控机制，并在肿瘤及其他疾病治疗方面具有潜在应用前景。

引言

天然通道蛋白（NCPs）能够在动态生理环境中响应外部刺激，从而快速、选择性地控制离子和水分子等物质跨细胞膜的运输。这一运输过程对于维持正常的生理功能至关重要。值得注意的是，这些蛋白质能够响应多种外部刺激，而非仅依赖单一信号来调控离子运输。例如，TRPV1作为一种多门控阳离子通道，可被多种内源性和外源性刺激激活，包括温度（> 43 °C）、化学试剂（如辣椒素和树胶脂毒素）以及pH变化。它参与体温调节、热痛和化学痛信号传导等生理过程。然而，开发具有多刺激响应行为的新型人工离子传输系统仍然是一项重大挑战。

图文导读

为评估H3‑AZO的质子传输性能，我们采用基于LUVs的HPTS荧光实验，并与未修饰的H3进行对比。LUVs由EYPC磷脂组成，内部包裹pH敏感性荧光探针HPTS，通过实时监测荧光强度变化观察H⁺内流。图1B显示，H3‑AZO的EC₅₀为4.82 µM（相当于2.5 mol%磷脂），而H3的EC₅₀为1.43 µM，表明偶氮苯基团的引入降低了质子传输活性，这可能归因于其膜嵌入能力的减弱，因为H3‑AZO的核心质子传输结构（富氧中心区域）与H3相比并未改变。

选择性实验方面，H3‑AZO在不同碱金属氯化物（MCl，M = Li、Na、K、Rb、Cs）中表现出相近的传输活性（约41%，图1D），说明其传输不依赖于碱金属阳离子。进一步采用缬氨霉素耗散膜电位，H3‑AZO与缬氨霉素联用可实现H⁺内流和K⁺外流的反向转运，活性从单独作用的12%和41%提升至81%，证明H3‑AZO选择性传输H⁺而排除Li⁺、Na⁺、K⁺等阳离子。阴离子选择性实验表明，H3‑AZO在排斥Cl⁻、Br⁻、NO₃⁻的同时高选择性地传输质子。此外，渗透压敏感的5(6)-CF实验证实H3‑AZO不传输水分子，而膜完整性实验显示其嵌入磷脂膜后不引起显著囊泡泄漏，与DMSO对照组相当，表明其在不破坏膜结构的前提下实现高选择性质子传输。以上结果综合表明，H3‑AZO与H3类似，具有高选择性质子传输能力，偶氮苯修饰不影响其离子选择性，后续平面脂双层实验也进一步定量验证了这一结论。

图 1. H3-AZO的质子传输活性与选择性评估。

为探究H3‑AZO的传输机制（通道机制或载体机制），我们进行了基于平面脂双层的膜片钳实验（图2A）。采用与H3相同的测试条件，在cis池和trans池中均加入0.25 M HCl水溶液（pH 0.6）。将H3‑AZO（0.5 µM）加入trans池并轻轻搅拌数分钟后，观察到清晰的方形通道电流信号，表明H3‑AZO与H3类似，通过通道机制实现质子传输。记录不同施加电压下的电流值，图2B‑C显示H3‑AZO的电流-电压（I‑V）关系符合欧姆定律，由I‑V曲线计算得其质子传输速率为103 ± 2 pS，低于H3（181 ± 4 pS），这与HPTS实验结果（图1B）一致，表明偶氮苯基团对H3表面的功能化导致质子传输活性和速率均有所下降。尽管速率降低，该值仍约为短杆菌肽A（gA，213 ± 4 pS）³⁹的一半，说明H3‑AZO仍能实现快速质子传输。

天然质子通道的氨基酸侧链富含氧和氮原子，可形成大量氢键链（HBCs），质子沿这些氢键链通过“跳跃”和“旋转”机制高效、选择性地跨膜运输⁷¹⁻⁷²（图2D‑E），H3‑AZO的质子传输方式与此类似。通过将cis池和trans池中的HCl水溶液替换为DCl·D₂O溶液（0.25 M DCl），评估了H3‑AZO的同位素效应（γ_H⁺/γ_D⁺）。如图2F‑G所示，在不同施加电压下记录了H3‑AZO的通道电流信号，由I‑V曲线测得D⁺传输速率为53 ± 1 pS，计算出γ_H⁺/γ_D⁺值为1.94。该值高于通过水线按Grotthuss机制传输质子的短杆菌肽（≈1.3），表明H3‑AZO介导的质子传输涉及聚合物骨架和水分子共同参与，而非通过脂双层内形成的水填充孔道进行。

图 2.对H3-AZO的质子传输机制及速率评估。

在探究H3‑AZO的门控特性之前，首先通过¹H NMR和UV-vis光谱考察了单体M1的光异构化行为。Trans‑M1经365 nm光照后，芳香质子信号发生明显低场位移（如Ha从8.15 ppm移至7.84 ppm），表明其转变为顺式构型；随后450 nm光照可使各信号恢复至原始位置，证明其可逆回复为反式构型。¹H NMR积分显示，365 nm和450 nm光照下达到光稳态时的反/顺比分别为18:82和79:21。UV-vis光谱进一步证实，365 nm光照下329 nm吸收峰逐渐降低、435 nm吸收带增强，450 nm光照则使上述变化逆转（图3A、3C、3E），且该异构化循环可多次重复而无明显衰减。H3‑AZO表现出与M1相似的光异构化行为。

此外，¹H NMR和UV-vis光谱证实Trans‑M1与β‑CD可形成主客体复合物，络合后相关质子信号发生高场位移（图3B、3D），329 nm吸收峰轻微蓝移并降低（图3F）。该复合物经365 nm光照后，Trans‑M1转化为Cis‑M1，导致主客体复合物解离，且通过交替光照可实现多次解离-络合循环。结合常数（Kₐ）经¹H NMR滴定测得为1561 ± 156 M⁻¹。H3‑AZO表现出与M1相似的主客体特性。上述结果表明，单体及聚合物的光异构化能力及其与β‑CD的主客体相互作用，为构建具有光门控和配体门控双重机制的人工质子跨膜传输系统奠定了基础。

图3.光异构化与主客体复合研究。

为验证光异构化和主客体络合能否调控质子运输，进行了HPTS实验。如图4A所示，Cis‑H3‑AZO的运输活性（55%）高于Trans‑H3‑AZO（32%），归因于顺式异构体极性增强，提高了膜插入效率（图4H）。通过交替光照，可实现运输活性的可逆调控（图4B‑D）。配体调控方面，适量β‑CD（14 µM）使运输活性从28%提升至62%，而过量β‑CD则因形成亲水复合物而关闭运输（图4E）。综上，光异构化和主客体络合均通过改变分子极性及膜插入能力来调控质子运输活性。

图 4.受光和配体调控的质子跨膜运输。

CCK‑8实验显示，H3‑AZO对B16F10和U87MG细胞的IC₅₀分别为0.38 μM和0.47 μM（图5A）。光门控和配体门控对细胞活性的影响表明，Cis‑H3‑AZO（IC₅₀ = 0.20 μM）的细胞毒性显著高于Trans‑H3‑AZO（图5B），Trans‑H3‑AZO/β‑CD复合物（IC₅₀ = 0.14 μM）的毒性也强于单独Trans‑H3‑AZO（图5C），证实增强的质子运输活性与增强的细胞毒性相关。流式细胞术（Annexin V/PI双染）显示，H3‑AZO处理组晚期凋亡细胞占比达94.6%，远高于对照组（1.32%），证实其诱导癌细胞凋亡（图5F）。

图 5. 可控的细胞毒性与癌细胞凋亡研究。

该论文第一作者为李聪博士后，通讯作者为杭州师范大学刘俊秋教授、博士后吴雅琪和徐政伟，南京大学曹毅教授作为共同通讯作者。该工作得到国家自然科学基金等项目的资助与支持。